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隆庆六年，穆宗驾崩，10岁的朱翊钧即位，年号万历，嘉靖四十一年，八月十七日，朱翊钧出生在裕王府，是穆宗朱载垕的第三子。穆宗有四子，长子朱翊釴、次子朱翊钤，俱早亡。四子朱翊镠与朱翊钧同为李氏所生。
朱翊钧的诞生给裕王府带来欢乐，王府张灯结彩，来道贺的人络绎不绝，热闹非凡。然而，这种喜庆的气氛很快就烟消云散了，代之的是人人自危的恐怖现象。原来朱翊钧的祖父嘉靖皇帝，对于这个皇孙的出世并不高兴，而是产生一种愤恨的心理。
因此，关于朱翊钧的诞生，没人敢报告皇帝，更不敢为之起名字，直到5岁时，这个皇孙才有了朱翊钧这个名字。穆宗说：赐你名字，名为钧，是说圣王制驭天下，犹如制器之转钧也，含义非常重大。你当念念不忘。
万历帝是穆宗的独子，隆庆二年，三月十一日，朱翊钧被立为皇太子，正位东宫。万历的生母李太后身世卑微原是宫人，后来母以子贵才晋升为贵妃。皇太子就是未来的皇帝，将来要治国治民，必须从小接受教育，了解以往帝王承业治国的经验教训，熟悉朝章典故，掌握驾驭臣民的本领。万历帝虽然年幼，却很懂得这个道理。穆宗任命一批大臣为教官，辅导他读书。朱翊钧学习非常用功。
其母李氏“教子颇严。帝或不读书，即召使长跪。每御讲筵入，尝令效讲臣进讲于前。遇朝期，五更至帝寝所，呼曰‘帝起’，敕左右掖帝坐，取水为盥面，挚之登辇以出”。由于讲官的尽心辅导，李太后的严格管教，以及他本人的刻苦努力，万历帝年渐长而学愈进。他自己后来也常常十分得意地说：“朕五岁即能读书。”
隆庆六年，五月二十二日，宫中传出隆庆帝病危的消息。二十五日，内阁大学士高拱、张居正、高仪被召入宫中。高拱等人进入寝宫东偏室，见隆庆帝坐在御榻上，榻边帘后坐着皇后陈氏、皇贵妃李氏，10岁的太子朱翊钧就立在御榻的右边。隆庆帝抓住高拱的手，临危托孤，“以全国使先生劳累”。司礼监太监冯保宣读给太子朱翊钧的遗诏：“遗诏与皇太子。朕不行了，皇帝你做。一应礼仪自有该部题请而行。你要依三辅臣并司礼监辅导，进学修德，用贤使能，无事荒怠，保守帝业。”三位大学士受托之后，掩泪而出。
第二天，隆庆帝即崩于乾清宫。六月初十，皇太子朱翊钧正式即位，次年改元万历。
即位之后，在读书方面，明神宗也是从一开始就坚持按照祖宗旧制，举日讲，御经筵，读经传、史书。在明朝的众皇帝中，除太祖之外，像神宗那样确实是不多见的。万历朝举人沈德符记叙，神宗即位后，就按照内阁首辅张居正的建议，每天于太阳初出时就驾幸文华殿，听儒臣讲读经书。然后少息片刻，复回讲席，再读史书。至午饭完毕时始返回宫内。只有每月逢三、六、九常朝之日，才暂免讲读。除此之外，即使是隆冬盛暑亦从不间断。
故十年之中，“圣学日新，坐致太平之治。昔英宗御极亦在幼冲，初不闻三杨诸公有此朝夕纳诲，遂使王振得盗国柄，几危宗社。则今上早年励精，真可只千古矣”。
明神宗即位时，摆在他面前一个突出的问题就是“柄臣相轧，门户渐开，而帝未能振肃朝纲，矫除积习”。这个问题，以后变得更为激烈。按照隆庆帝的布置，高拱是外廷的顾命大臣中排名最前的；在宫中，朱翊钧自然依靠冯保。但是，冯保与高拱的关系非常恶劣。此前，司礼监掌印太监职位空缺，高拱先后推荐了陈洪、孟冲，就是不愿让冯保做掌印太监。神宗自己在登极诏中也命令他们：朕方在冲年，尚赖文武亲贤，“共图化理”，“与民更始”。
冯保此人知书达礼，又喜爱琴棋书画，很有涵养，所以很受隆庆帝的喜爱。冯保利用皇权更迭之间的权力真空，轻松地通过一道遗诏，就驱走了孟冲，自己做了掌印太监。但是，就高拱来说，对冯保自然是必欲除之而后快，在高拱的授意下，工科都给事中程文、吏科都给事中雒遵、礼科都给事中陆树德都开始弹劾冯保。
由此，一场政治斗争势必不免，斗争中，冲突双方是冯保和高拱，而张居正表面上是帮助高拱的。但实际上，张居正与冯保关系非常密切，早就预谋赶走高拱。